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人脐血间充质干细胞体外终末分化为神经元样细胞.doc
文档介绍:
人脐血间充质干细胞体外终末分化为神经元样细胞.doc人脐血间充质干细胞体外终末分化为神经元样细胞
【关键词】间充质干细胞人脐血分化神经元
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC) 是目前备受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞, 最先发现于骨髓, 随后在脐血和其他组织中也发现了MSC。研究报道MSC在体外诱导条件下不仅可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞等多种中胚层的间质细胞[1], 而且还能跨胚层横向分化为神经细胞[2]。我们在分离培养人脐血MSC的过程中发现部分脐血MSC在体外培养多次传代的过程中未经诱导表现为类似神经元的形态, 因此采用RTPCR和免疫细胞化学的方法对脐血MSC能否表达神经元特异性抗原标记进行检测。
1 材料和方法
1.1 材料淋巴细胞分离液(1.077 g/mL)购自中科院天津血液病研究所; DMEMLG培养基购自Sigma公司; 胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司; 青/链霉素、谷氨酰***、 2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA购自Gibico公司; 鼠抗人CD29FITC、 CD44FITC、 CD105FITC、 CD34FITC、 CD106FITC、 HLADRPE单克隆抗体(mAb)及同型对照购自Coulter公司; 鼠抗人神经元特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase, NSE)和神经丝蛋白(neurofilament, NF)mAb工作液, EliVisionTM Plus试剂盒购自北京中杉生物技术公司。
1.2 方法
1.2.1 PCR扩增引物根据GenBank上登录的NSE、 NF基因序列设计, 由上海生工生物工程有限公司合成。NSE引物为: 5′tgcaactg3′, 5′ccaggtcagcaatgaatgtg3′; NF引物为: 5′atcggtaaaggtgcacttgg3′, 5′attgacagc3′。扩增片段长度分别为157 bp和168 bp。
1.2.2 脐血标本的收集脐血于南京军区福州总医院妇产科出生的健康足月顺产新生儿。产妇产前检查均正常, 脐血的收集均已征得产妇同意。无菌条件下采集脐血: 待胎儿娩出后, 在距离胎儿5~7 cm的脐带处进行双接扎, 剪断脐带, 穿刺脐静脉后抽取脐血, 每份30~80 mL, 抽取后注入100 mL, 经无菌处理, 加入333.4 nkat/mL肝素抗凝的生理盐水瓶中, 充分混匀。脐血采集后4 h内进行单个核细胞的分离。
1.2.3 脐血单个核细胞的分离采用密度梯度离心法: 脐血30~80 mL用无菌的D
Hank’s液等体积稀释。取数个50 mL的无菌带盖离心管, 先加入1.077 g/mL的淋巴细胞分离液25 mL, 无菌滴管吸取稀释后的脐血25 mL, 离液面约1 cm处缓慢加入, 形成一明显的界面。2 000 r/min离心20 min, 小心吸取中间的白膜层。加入5倍体积的PBS缓冲液, 1 000 r/min离心10 min, 洗涤3次, 弃上清。所得单个核细胞用于细胞培养。
1.2.4 脐血分离细胞的培养和传代参照骨髓MSC的培养方法[3]从脐血中分离出的单个核细胞以1.0×109 内容来自淘豆网www.taodocs.com转载请标明出处.
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